Procedente del Perú, en 1536, Diego de Almagro exploró el norte, en búsqueda de un paso hacia Chile, y en 1543, Diego de Rojas avanzó sobre el Tucumán, desde idéntico origen, ingresando por la Puna jujeña. Si bien Rojas murió al ser alcanzado por una flecha envenenada en el territorio actual de Santiago del Estero, la expedición siguió adelante bajo la dirección de Francisco de Mendoza, y consiguió llegar hasta el Río Paraná. El trato autoritario de Mendoza provocó el amotinamiento de sus subordinados, quienes finalmente lo ejecutaron y retornaron al Perú, sin haber obtenido ningún resultado apreciable.

Una tercera expedición al NOA desde el Perú se concretó en 1549, a cargo de Juan Núñez de Prado. En 1550 fundó la ciudad de El Barco, en sierra del Aconquija (Tucumán). Poco después se presentó allí Francisco de Villagra, lugarteniente del conquistador de Chile, Pedro de Valdivia, reclamando la titularidad de esas tierras, según la capitulación que poseía su jefe. Núñez del Prado evitó el conflicto y trasladó su asentamiento hacia los valles Calchaquíes, zona de difícil acceso donde se habían refugiado varias tribus nativas, escapando de la violencia de los conquistadores.

Tras fundar nuevamente El Barco, Núñez no pudo doblegar a los diaguitas, pueblo originario de avanzada cultura que habitaba el NOA y el norte de Chile y que venía de oponer una firme resistencia a la conquista incaica, entre 1470 y 1533. Por este motivo, Núñez decidió reubicar El Barco nuevamente, esta vez junto al Río Dulce (Santiago del Estero). Inmediatamente Valdivia reclamó sus derechos capitulares y comisionó a Francisco de Aguirre para que tomara el control del poblado y enviara detenido a Núñez al Perú. Una vez en control de la situación, Aguirre decidió trasladar la ciudad a un territorio más alto ubicado en las proximidades y la refundó con el nombre de Santiago del Estero en 1553. En las cercanías de Santiago del Estero se fundaron, durante los diez años siguientes, tres ciudades que servirían en la defensa ante eventuales ataques de los nativos: Cañete, Londres y Córdoba del Calchaquí.

Estos asentamientos serían destruidos durante el levantamiento de Juan Calchaquí, el cacique de los omeguacas (un subgrupo de los diaguitas que habitaba Tilcara y la quebrada de Humahuaca), en represalia por el mal trato a que los sometía el gobernador. En 1563, Felipe II dispuso que el Tucumán pasara a depender de la Audiencia de Charcas (Perú) y repuso a Francisco de Aguirre como gobernador de Santiago del Estero. Aguirre dispuso la reconstrucción de las ciudades destruidas y, en 1565, Diego de Villarroel fundó San Miguel de Tucumán sobre el anterior asentamiento de Cañete.

Jerónimo Luis de Cabrera, quien sucedió a Aguirre, trató de tomar distancia de la Audiencia de Charcas y apuntó a extender la conquista hacia el Atlántico para entrar en relación directa con España. Como parte de este proyecto, demasiado ambicioso para convertirse en realidad por entonces, Cabrera fundó la ciudad de Córdoba en 1573. No era Cabrera el único en advertir la conveniencia de encontrar una vía de comunicación más directa con España que la ofrecida por el puerto de El Callao (Perú).

En 1568, Juan de Garay fue designado como alguacil mayor por el gobernador de Asunción y pocos años después se le encomendó la fundación de ciudades a la vera de los ríos, con el fin de recuperar Buenos Aires y así posibilitar una comunicación directa con la Corona. Garay contaba con una amplia trayectoria en la conquista de los territorios americanos, tras haber participado en la expedición de Núñez de Prado, la fundación de Santa Cruz de la Sierra (Bolivia, 1561), y ejercido diversas funciones administrativas dentro del aparato colonial. En 1573 Garay inició su empresa fundadora y en el camino al Paraná se encontró con Cabrera, que avanzaba desde Córdoba con fines similares pero que reconoció el derecho que asistía a Garay sobre la zona. El alguacil enviado por Asunción procedió a fundar la Ciudad de Santa Fe el 15 de noviembre de 1573. Luego, designó a los miembros del Cabildo, quienes a su vez procedieron a nombrarlo gobernador.

Recién a principios de 1580, Garay se aprestó a concluir su misión de refundar Buenos Aires. El proyecto sería igual al efectuado exitosamente en el caso de Santa Fe: traería población de Asunción, ofreciéndole tierras y otros beneficios. La expedición incluyó, entonces, a 76 familias de colonos y 200 de guaraníes, así como a 39 soldados. La inclusión de los guaraníes se debía a sus hábitos sedentarios, su dominio de la agricultura y su escasa resistencia al dominio de los españoles. La refundación se concretó, finalmente, el 11 de junio de 1580, con el nombre de Trinidad y Puerto de Santa María del Buen Ayre. La nueva fundación fue atacada por los nativos del lugar, pero fueron derrotados junto con su jefe, Tububá, quien fue asesinado.